Profesora Margarita Salas

Profesora Margarita Salas

El bacteriófago ø29. De la Biología Molecular a la Biotecnología

Texto del discurso presentado para la recepción del Doctorado Honoris Causa por la Universidad Carlos III
Margarita Salas
Instituto de Biología Molecular “Eladio Viñuela” (CSIC)
Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC–UAM)
Universidad Autónoma de Madrid, Canto Blanco
28049 Madrid

13 de septiembre de 2018

Excmo. y Magnífico Sr. Rector, Excelentísimas e Ilustrísimas Autoridades, Claustro de Doctores, Sras. y Sres.:
En primer lugar quiero dar las gracias a todos los miembros de la Universidad Carlos III por la distinción que hoy voy a recibir. Mi agradecimiento especial al Rector Profesor Juan Romo, a mi padrino el Profesor Juan José Vaquero, así como al Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial por su propuesta.  Es para mi un gran honor estar hoy aquí recibiendo el Doctorado Honoris Causa por esta Universidad.
En mi discurso voy a resumir cómo llegué a la Biología Molecular, así como mis vivencias científicas de los 56 años de mi vida dedicada a la investigación. De éstos, cerca de 40 van unidos a Eladio Viñuela, con quien compartí este período importante de nuestras vidas.
Yo nací en Canero, un pequeño pueblo asturiano cerca de Luarca. Cuando tenía un año mis padres se instalaron en Gijón, que fue donde pasé mi infancia y primera juventud junto a mis hermanos Pepe y Marisa.
Mi hermana y yo tuvimos la suerte de que nuestros padres nunca nos discriminaron respecto a mi hermano por el hecho de ser mujeres. Ellos tenían muy claro que nuestro futuro dependería de nuestro trabajo y que debíamos seguir una carrera universitaria. Así, después de 6 años de Bachillerato inicié el curso preuniversitario y tuve que elegir entre ciencias y letras. Me decidí por las ciencias, pero cuando llegó la hora de iniciar la carrera universitaria dudaba entre estudiar Ciencias Químicas o Medicina. Me vine a Madrid para cursar lo que se llamaba el curso selectivo que me daría la opción de elegir un año más tarde la carrera que quería estudiar. Finalmente, me decidí por la licenciatura de Ciencias Químicas. Pronto me fascinaron las largas horas que pasábamos en el laboratorio, en especial en el de Química Orgánica, asignatura impartida en el 3er curso de la licenciatura. Cuando terminé ese curso pensaba que mi futuro podría ser la investigación en Química Orgánica. Pero me equivoqué. Ese verano me fui a Gijón a pasar las vacaciones y allí tuve la suerte de conocer a Severo Ochoa quien influyó decisivamente sobre mi futuro. Asistí a una conferencia que dio sobre su trabajo, que me fascinó, y tuve la ocasión de hablar con él. En aquel momento yo no había estudiado Bioquímica, que se impartía en el 4º curso de la licenciatura. Ochoa prometió enviarme un libro de Bioquímica cuando llegase a Nueva York. Cumplió su palabra y me envió el libro “General Biochemistry” de Fruton y Simmonds. El libro lo leí con gran entusiasmo, y la asignatura de Bioquímica de 4º curso me atrapó, por lo que cuando estaba a punto de terminar la carrera le dije a Ochoa que quería dedicarme a la investigación en Bioquímica. Ochoa me recomendó que hiciese la Tesis Doctoral en Madrid con un excelente Bioquímico, Alberto Sols, para después irme con él a Nueva York a realizar una estancia postdoctoral  e iniciarme en la Biología Molecular.
Mi trabajo de Tesis consistió en el estudio de la conversión de glucosa–6-fosfato en fructosa-6-fosfato en una reacción catalizada por la glucosafosfato isomerasa, con especial hincapié en una actividad tipo anomerasa del enzima, cuyo producto intermedio es glucosa-6-fosfato acíclico. Con este trabajo vislumbré por primera vez en mi carrera científica lo que Severo Ochoa llamaba la emoción de descubrir. Había descubierto una propiedad de la glucosafosfato isomerasa inédita hasta la fecha, que era su actividad de anomerización.
Durante mi fase de doctorado colaboré con Eladio en el estudio de la glucoquinasa de hígado, un nuevo enzima que había descubierto Eladio como primer paso en la ruta de la glucosa al glucógeno en hígado, que daba lugar a la formación de glucosa-6-fosfato. Posteriormente, demostramos que la síntesis de la glucoquinasa de hígado de rata es dependiente de insulina. El enzima desaparece en animales diabéticos o en animales a los que se ha sometido a ayuno, y se resintetiza por administración de insulina o por realimentación, respectivamente. 
En 1964, una vez finalizada nuestra tesis doctoral, nos marchamos al laboratorio de Severo Ochoa en el Departamento de Bioquímica de la Escuela de Medicina de la Universidad de Nueva York.  En aquel momento, se acababa de terminar la fase febril del desciframiento de la clave genética. Ochoa me dio como tema de investigación el determinar la dirección de lectura del mensaje genético. Un año más tarde publicábamos el primer trabajo sobre este tema, demostrando que el RNA mensajero se lee en la dirección 5’ a 3’. Posteriormente, en 1966, descubrí dos nuevas proteínas en Escherichia coli, que resultaron ser los dos primeros factores de iniciación de la síntesis de proteínas. Este fue el segundo momento de mi vida científica en que sentí la emoción de descubrir. Aunque Eladio y yo trabajamos mayoritariamente de un modo independiente en esta etapa postdoctoral, también colaboramos en determinar que todas las proteínas sintetizadas en E. coli después de la infección con el fago MS2 comienzan con formil-metionina, utilizando la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico que había puesto a punto Eladio.
De la estancia en el laboratorio de Severo Ochoa guardo un recuerdo imborrable. Severo Ochoa nos enseñó, no solamente la Biología Molecular que después pudimos desarrollar y enseñar a nuestra vuelta a España, sino también su rigor experimental, su dedicación y su entusiasmo por la investigación. El seguía día a día el trabajo que se hacía en el laboratorio, y a diario discutíamos con él los experimentos que se habían hecho, y planeábamos los que había que realizar. Tengo un recuerdo especialmente agradable de los almuerzos en los que, además de largas discusiones sobre ciencia, también se hablaba de música, de arte, de literatura, de viajes. Era un rito el paso de Severo Ochoa a las 12 en punto por nuestros laboratorios para recogernos de camino al comedor de la Facultad.
También tengo un excelente recuerdo de las clases que se impartían a los estudiantes de Medicina por los profesores del Departamento, y a las que asistíamos todos los miembros del mismo. Ello nos dio ocasión de aprender la Biología Molecular desde el punto de vista teórico de la mano de Severo Ochoa y de otros grandes profesores del Departamento. 
Cuando se acercaban los tres años de estancia en el laboratorio de Ochoa, Eladio y yo tomamos la decisión de volver a España a tratar de hacer investigación en Biología Molecular en nuestro país. Pensamos que no deberíamos seguir trabajando en nuestros temas de trabajo respectivos, muy competitivos en aquella época, ya que éramos conscientes de que teníamos que organizar un laboratorio e iniciar un nuevo grupo de investigación. Habíamos asistido a un curso sobre virus bacterianos o bacteriófagos en los laboratorios de Cold Spring Harbor. Precisamente el estudio de los bacteriófagos había dado lugar al nacimiento de la Genética Molecular en los años 50 mediante el trabajo del llamado grupo de los fagos dirigido por Max Delbrück. Así pues, elegimos como sistema de trabajo el bacteriófago ø29 que infecta a Bacillus subtilis, no muy estudiado por entonces, de tamaño relativamente pequeño (~19000 pares de bases) para poder estudiarlo en profundidad a nivel molecular, pero a la vez morfológicamente complejo, lo que le hacía un modelo atractivo desde el punto de vista del estudio de la morfogénesis de la partícula viral, es decir, como se ensamblan las distintas proteínas que forman la estructura del virus para dar lugar al virus maduro. 
En aquella época, a mediados de 1967, no existía en España ningún tipo de ayuda estatal para realizar investigación, por lo que hicimos nuestra primera petición de una ayuda a Estados Unidos, a la Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research y, con el apoyo de Severo Ochoa, conseguimos la financiación, algo que fue esencial para nuestros comienzos en España. En el Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid recibimos también el apoyo de José Luis Rodríguez Candela, Director del Instituto Gregorio Marañón del CSIC, quien generosamente nos cedió un laboratorio donde comenzamos nuestra andadura científica en España. Afortunadamente, a finales de 1967 se convocaron las primeras becas del Plan de Formación de Personal Investigador con lo que pudimos tener nuestros primeros estudiantes predoctorales.
Con nuestro primer doctorando, Enrique Méndez, estudiamos la estructura de la partícula viral y la caracterización de las diferentes proteínas que forman las distintas estructuras del fago, lo que dio lugar al primer trabajo del nuevo grupo, en la revista Virology, y también a la primera tesis doctoral. 
En paralelo, iniciamos el estudio de la genética del fago con el aislamiento de mutantes letales condicionales (sensibles a temperatura y sensibles a supresor). Ello llevó al estudio de la morfogénesis de la partícula viral y al descubrimiento de la existencia de proteínas morfogenéticas, que forman parte transitoriamente de la partícula viral, pero no están presentes en el fago maduro. 
Por otra parte, con Jesús Ávila iniciamos el estudio de la transcripción del DNA del fago mediante la purificación y caracterización de la RNA polimerasa de la bacteria huésped de ø29, B. subtilis. Posteriormente, con José Miguel Hermoso demostramos la existencia de un control temporal en la transcripción del DNA del virus; los llamados genes tempranos se transcriben al comienzo de la infección por la RNA polimerasa de B. subtilis y los genes tardíos se transcriben posteriormente, y requieren, además de la RNA polimerasa, un gen viral temprano, el gen 4.
En 1972, utilizamos por primera vez una nucleasa de restricción en España, la EcoRI, que purificó José Mª Lázaro, haciendo el primer mapa en el que se correlacionaba el mapa físico y genético de ø29.
En 1970, Eladio se aventuró en un nuevo tema de trabajo: el estudio del virus de la Peste Porcina Africana. Esto tenía para él un doble aliciente: por una parte, iniciaba un tema muy importante tanto desde el punto de vista básico como de sus aplicaciones en la resolución de un problema que afectaba gravemente a la cabaña porcina española, en particular en sus tierras extremeñas; por otra parte, me dejaba a mi el camino independiente en el estudio del bacteriófago ø29.
La llegada de la nueva tecnología de la Ingeniería Genética nos abrió nuevos caminos en el estudio del fago ø29: el clonaje de genes para la sobreproducción de las proteínas correspondientes así como la mutagenesis dirigida para realizar estudios de correlación de estructura y función. Así,  clonamos el gen 4, y la proteína producida en cantidades altas se purificó y se desarrolló un sistema de transcripción in vitro en el cual la proteína p4 se requería para la transcripción del promotor tardío en presencia de la RNA polimerasa de B. subtilis.  Demostramos que la proteína p4 es un activador transcripcional que además de activar la transcripción tardía es un represor de dos promotores tempranos. Por otra parte, la proteína viral temprana producto del gen 6, que se requiere para la iniciación de la replicación del DNA viral, coopera con la proteína reguladora p4 en la activación del promotor tardío y en la represión de dos promotores tempranos. Así pues, el sistema de regulación de la expresión del DNA de ø29 es un sistema complejo que puede servir como modelo de mecanismo de control de la expresión genética. Quiero citar aquí, entre otros, a Isabel Barthelemy, Fernando Rojo, Mario Mencía, María Monsalve, José Antonio Horcajadas, Ana Camacho y Monserrat Elías-Arnanz. Posteriormente, en colaboración con el grupo dirigido por Miquel Coll en el Instituto de Investigación Biomédica de Barcelona (IRB), hemos obtenido la estructura tridimensional de la proteína p4, así como la de la p4 unida al DNA, lo que nos ha abierto el camino para el estudio de las interacciones que tienen lugar entre la p4 y el DNA, así como de la p4 con otras proteínas como la RNA polimerasa y la p6.
El estudio de la replicación del DNA de ø29 surgió como consecuencia del descubrimiento por Juan Ortín de una proteína unida covalentemente a los extremos 5' del DNA que daba lugar a formas circulares que se convertían en DNA lineal de longitud unidad por tratamiento con enzimas proteolíticas. Por microscopía electrónica, José Manuel Sogo pudo visualizar dicha proteína en los dos extremos del DNA de ø29. Esta proteína, producto del gen 3 viral, se denominó proteína terminal.
También por microscopía electrónica caracterizamos los intermedios replicativos en bacterias infectadas por ø29 llegando a la conclusión de que la replicación se inicia en los extremos del DNA por un mecanismo de desplazamiento de cadena. Posteriormente, con Miguel Ángel Peñalva, demostramos que la iniciación de la replicación del DNA de ø29 tiene lugar utilizando la proteína terminal como iniciador. Esto ha supuesto el descubrimiento de un nuevo mecanismo para la iniciación de la replicación de genomas lineales.  Las dos proteínas esenciales para la iniciación de la replicación del DNA de ø29 son la proteína terminal y la DNA polimerasa viral que forman inicialmente un heterodímero. Los genes fueron clonados por Juan Antonio García y Luis Blanco, respectivamente. Estas dos proteínas, una vez iniciada la replicación se separan, quedándose la proteína terminal unida covalentemente al DNA, y la DNA polimerasa prosigue la replicación dando lugar in vitro a DNA de ø29 de longitud unidad de un modo muy procesivo. Esto quiere decir que la DNA polimerasa, una vez que inicia la replicación de una cadena de DNA, continúa hasta el final, sin pararse ni disociarse. Además, la DNA polimerasa tiene una actividad intrínsica de desplazamiento de cadena. Estas propiedades de la DNA polimerasa de ø29 caracterizadas por Luis Blanco han sido la base para su aplicación biotecnológica.
Por otra parte, con Juan Méndez demostramos que la replicación se inicia en la timina que ocupa la segunda posición desde el extremo 3' y no en la timina que ocupa la primera posición. Esto, junto con el requerimiento de una reiteración terminal de al menos dos nucleótidos, nos ha llevado a postular un nuevo mecanismo que hemos llamado de deslizamiento hacia atrás o "sliding back". Este modelo tiene implicaciones importantes para mantener intactos los extremos del DNA de ø29.
En 1982, Cristina Garmendia realizó los primeros trabajos de mutagénesis dirigida en la proteína terminal de ø29 y posteriormente, Luis Blanco, Antonio Bernad, María Antonia Blasco, Miguel de Vega y muchos otros doctorandos lo hicieron en la DNA polimerasa en un estudio de correlación de estructura y función.
Posteriormente, en colaboración con el grupo de Tom Steitz de la Universidad de Yale se ha determinado la estructura tridimensional de la DNA polimerasa de ø29, siendo la primera vez que se determina la estructura de una polimerasa que utiliza una proteína terminal como iniciadora. Esto nos ha permitido determinar la estructura responsable de las propiedades de procesividad y desplazamiento de cadena de la DNA polimerasa de ø29, que son únicas para esta polimerasa.
Otra proteína implicada en el proceso de replicación es la proteína p5, caracterizada como una proteína de unión a DNA de cadena simple. Por microscopía electrónica Crisanto Gutiérrez demostró su unión a la cadena simple desplazada en los intermedios replicativos del DNA de ø29.
También me quiero referir de nuevo a la proteína p6, que el trabajo de Manolo Serrano, entre otros, demostró que se une a los orígenes de replicación del DNA de ø29 formando un complejo nucleoprotéico que estimula la iniciación de la replicación favoreciendo la apertura de los extremos del DNA. 
A su vez, Gemma Serrano demostró que otra proteína viral, la p56, interacciona con la uracil-DNA glicosilasa de B. subtilis, y evita la inestabilidad del DNA de ø29 cuando se incorporan residuos de uracilo al mismo.
También quisiera resaltar el papel de proteínas de B. subtilis como las del citoesqueleto, que Daniel Muñoz-Espín demostró que se requieren para la replicación del DNA de ø29, o la proteína Spo0A, que Wilfried Meijer y Virginia Castilla demostraron que interfiere con la replicación y la transcripción del DNA de ø29 en bacterias que empiezan la fase de esporulación.
A su vez, Daniel Muñóz-Espín determinó que el fragmento N-terminal de la proteína terminal se requiere para la localización de esta en el nucleoide bacteriano, y Modesto Redrejo ha determinado que dicho fragmento N-terminal contiene una señal de localización nuclear y se localiza en el núcleo eucariótico.
Quisiera terminar el breve resumen que he hecho de nuestro trabajo con un aspecto práctico del sistema de replicación in vitro del DNA de ø29, que da lugar a amplificación del DNA. Con Luis Blanco demostramos que en presencia de las cuatro proteínas de replicación esenciales, la proteína terminal, la DNA polimerasa, y las proteínas p5 y p6, cantidades pequeñas de DNA de ø29 se amplifican unas 1000 veces dando lugar a la síntesis in vitro de DNA de unidad de longitud. El DNA amplificado in vitro es tan infectivo como el DNA aislado de partículas virales cuando se transfectan células competentes de B. subtilis. Por otra parte, la actividad de apertura de doble hélice de la DNA polimerasa de ø29, unida a su procesividad y a su capacidad de corrección de errores de replicación, han dado lugar a una aplicación biotecnológica de la DNA polimerasa de ø29 con unos excelentes resultados en la amplificación de DNA circular con iniciadores múltiples mediante el mecanismo llamado de la rueda giratoria. Posteriormente, se extendió la aplicación biotecnológica a la amplificación de DNA genómico lineal. Quiero citar aquí a los inventores de la patente que ha dado lugar a estas aplicaciones: Luis Blanco, Antonio Bernad, José Mª Lázaro y yo misma.
Más recientemente, Miguel de Vega ha construido DNA polimerasas quiméricas con una mayor capacidad de amplificación del DNA y Mario Mencía ha podido amplificar, utilizando la proteína terminal como iniciadora, DNA heterólogo que contiene los orígenes de replicación del DNA de ø29 sin la proteína terminal paterna.
Quiero resaltar el hecho de que de un trabajo fundamentalmente básico se han derivado importantes aplicaciones biotecnológicas para la amplificación de DNA. También quiero indicar que nuestros estudios de replicación con el DNA de ø29 son un modelo extrapolable a otros virus de interés sanitario y económico, como el adenovirus humano, el virus de la poliomelitis, el de la encefalomiocarditis, los virus de la hepatitis B y C, y una variedad de virus de plantas.
Como decía Severo Ochoa, hay que hacer investigación básica de calidad y hay que dejar libertad al investigador. De este trabajo libre surgen los grandes descubrimientos que redundan en beneficio de la humanidad. Aplicaciones prácticas que ha dado la Biología han surgido como resultado de proyectos de investigación básica. Como es bien sabido de todos y como también decía Severo Ochoa, un país sin investigación es un país sin desarrollo. Es necesario que potenciemos nuestra investigación básica de calidad pues ella será la base para el desarrollo de nuestro país.
Otra gran satisfacción que me ha dado la investigación es la enseñanza, tanto a nivel de licenciatura como a nivel de estudiantes de doctorado y postdoctorado.
En relación con la primera, yo impartí durante 23 años la asignatura de Genética Molecular en la Facultad de Químicas de la Universidad Complutense de Madrid. Esto me dio muchas satisfacciones y me permitió seleccionar excelentes estudiantes de doctorado. Durante 51 años de mi vida científica con el fago ø29 se han realizado en el laboratorio un total de 55 tesis doctorales. Es una enorme satisfacción formar futuros científicos, dirigirlos y alentarlos en los muchos momentos de desánimo que existen a lo largo de los cuatro años que dura una tesis doctoral. Pero sobre todo, ser testigo de sus éxitos, muchos de ellos como jefes de grupo con su investigación propia obteniendo importantes resultados científicos.
Quiero resaltar que los 55 doctorandos que se han formado en el laboratorio, otros muchos doctores que han obtenido una formación postdoctoral y los técnicos que han pasado y/o que están actualmente en el laboratorio formamos una gran familia formada por hijos, nietos y hasta bisnietos científicos. Cuando nos reunimos con ocasión de algún acontecimiento científico y/o personal siento una gran alegría y una enorme satisfacción. El orgullo de ver que muchos discípulos me han superado.
Hemos recorrido un largo camino desde que Eladio y yo iniciamos nuestro trabajo en Biología Molecular a nuestra vuelta a España en 1967. La investigación en Biología Molecular se ha potenciado de un modo importante. Existen grupos de indudable calidad en España. Pero es necesario potenciar la cantidad, en particular la recuperación de jóvenes investigadores excelentemente preparados.
Finalmente, quiero resaltar que el trabajo que acabo de resumir es el resultado de la dedicación de muchas personas que han trabajado en el grupo de ø29 a lo largo de cincuenta y un años, muchas de las cuales tienen sus propios grupos de investigación y están realizando un trabajo excelente. Mi más profundo agradecimiento a todas ellas, y en particular a las personas que están actualmente en el grupo y a las que me ayudan en la dirección y buena marcha del mismo. Quiero mencionar de un modo especial a José Mª Lázaro, quien trabajó conmigo desde 1972 y ha representado la memoria científica del grupo y a Mª Ángeles Martínez quien desde hace veintidós años me ayuda y me protege como un verdadero ángel de la guarda. Mi agradecimiento a mis dos maestros de las fases predoctoral y postdoctoral, Alberto Sols y Severo Ochoa, respectivamente, quienes me enseñaron, no solo la Bioquímica y la Biología Molecular, sino también su rigor experimental, su dedicación y su entusiasmo por la investigación. A mis padres, quienes siempre me facilitaron el desarrollar mi carrera profesional. A mis hermanos, Pepe, quien ya no está con nosotros, y Marisa, ambos científicos, por su continuo apoyo, a mis colegas y amigos, por su apoyo y amistad. A nuestra hija Lucía pues siempre me ha apoyado en mi dedicación a la investigación. Y muy especialmente a Eladio, con quien compartí los momentos difíciles de iniciar la investigación en España sobre el bacteriófago ø29. Tener a Eladio a mi lado ha sido para mi un estímulo constante. Su consejo siempre acertado ha estado apoyándome continuamente. Eladio ha sido para mi, no solo un marido, sino también un amigo y un maestro. De hecho, el mejor de mis maestros. Ciertamente sin su ayuda, apoyo y estímulo constantes no estaría yo aquí recibiendo este Doctorado Honoris Causa por la Universidad Carlos III que tanto me honra y satisface.

Muchas gracias.